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Biotecnología aplicada a la conservación de
objetos de patrimonio cultural mediante el
uso de irradiación gamma

La preservación de objetos de patrimonio cultural en el mundo, se ha vuelto un tema de suma importancia y múltiples desarrollos e investigaciones. La tecnología de irradiación gamma se  ha vuelto fundamental en la lucha contra el deterioro por diversos agentes biológicos.

Ing. Javier C. Ramírez Pérez
Ph.D. - Profesor Investigador en biotecnología ambiental

Daniel Perticaro, Presidente de ALATI

Diferentes objetos de PC biodeteriorados por biodeteriogenes.

Resumen

En la mayoría de los países de Latinoamérica los objetos de Patrimonio Cultural (PC) se encuentran almacenados en museos, instituciones religiosas y otros lugares, donde su almacenamiento es sujeto de una potencial contaminación por hongos y bacterias, estos agentes de biodeterioración (biodeteriogenes) juegan un rol importante en la biodegradación de objetos de PC. Los principales biodeteriogenes son los hongos debido a su gran actividad enzimática y su aptitud de crecer a bajos valores de aw (humedad relativa), son capaces de habitar y biodegradar pinturas, textiles, papel, pergaminos, cuero, caseína, aceite, pegamento, cerámica, monumentos de piedra, arcilla y otros materiales utilizados como objetos de PC y objetos de arte históricos. Mientras que los objetos de PC almacenados en un ambiente controlado de baja humedad y temperatura, el crecimiento de hongos puede permanecer restringido por varios años, aunque estos hayan sido contaminados antes del almacenamiento. Otros almacenados en lugares sin ningún control de las condiciones ambientales internas, la contaminación por hongos se propaga ampliamente sobre estos. Además, se encuentran descoloridos o manchados debido a otros factores. La erosión en monumentos de piedra o arcilla está relacionada con casi todos los procesos ambientales inducidos de biodegradación y es acelerada por la presencia de hongos epi-y endoliticos. Con ayuda de la biotecnología es posible la identificación de estos biodeteriogenes hasta encontrar su género molecular específico. Con objeto de eliminar la colonización en forma de películas delgadas sobre la superficie de estos objetos de PC para su preservación y conservación, varios métodos físicos y químicos han sido explorados, cada uno con ventajas y desventajas. Sin embargo, la irradiación gamma es uno de los métodos físicos más prometedores para la eliminación de biodeteriogenes en objetos de PC que se reporta en esta publicación.

1. Introducción

Los objetos de PC manufacturados de diferentes materiales por nuestros ancestros sufren con el tiempo una deterioración debido a modificaciones físicas, químicas, biológicas y morfológicas producidas por condiciones ambientales desfavorables. La biodeterioración es un problema relevante en la conservación de objetos de PC debido a que representa un grupo de nichos ecológicos de varios organismos. Se acelera bajo condiciones inadecuadas de almacenamiento, una exposición temporal o permanente a la humedad favorece el crecimiento microbiano. Hay factores abióticos y bióticos que tienen efectos en la biodeterioración de materiales utilizados para la construcción de objetos de arte, tales como humedad, luz, contaminación, temperatura, y varios tipos de biodeteriogenes. Entre los principales bioteriogenes están los hongos y bacterias. En ambientes internos los hongos crecen a relativamente bajos niveles de aw y temperatura, las esporas de hongos son capaces de sobrevivir en condiciones severas por mucho tiempo. En cambio, el crecimiento de las bacterias es limitada por su necesidad de agua. En pinturas, los biodeteriogenes son muestreados desde los materiales de soporte que se usan para adherir las mismas al soporte como pegamentos (plantas o animales), aglutinantes organicos en los cuales los pigmentos se emulsifican (aceites, ceras, polisacaridos). Estos sirven como sustrato para los biodeteriogenes. En materiales de madera, papel, pergaminos, cerámica o textiles es la celulosa y hemicelulosa que sirve como sustrato. Actualmente, los materiales de arte contemporáneo incluyen materiales sintéticos los cuales también son potenciales sujetos de biodeterioración y presentan desafíos en su manejo, almacenamiento, conservación y preservación y exhibición. Dependiendo de la naturaleza química del material, diferentes metabolismos pueden ser desarrollados, produciendo daños tanto estéticos como estructurales en los objetos de PC. Por tanto, utilizando herramientas que brinda la biotecnología junto a los métodos de microscopia electrónica es posible la caracterización, identificación de los biodeteriogenes, incluso el tipo de biodeterioración causado para poder evaluar el impacto sobre el estado de los objetos de PC, para aplicar metodos de tratamiento adecuados para su preservación y conservación. La irradiación gamma, es un método físico muy prometedor, adecuado para la eliminación de biodeteriogenes como se explica más adelante.

2. Biodeterioración

Biodeterioración es un problema relevante en la conservación de PC porque representa un amplio y diverso grupo de nichos ecológicos que comprende varios microorganismos denominados biodeteriogenes. Es causada por factores bióticos y abióticos. Los primeros compuestos por hongos y bacterias- principales biodeteriogenes- que colonizan en las superficies de materiales derivados de celulosa como papel, madera, textiles, cuero, pinturas, así como sobre otros materiales como, piedra y arcilla utilizados en cerámica y monumentos arqueológicos, que son además atacados por otros biodeteriogenes como: micromicetos, cilios, musgos, líquenes, cianobacterias, algas, artrópodos y vertebrados. Los factores abióticos se refieren a factores ambientales como: la humedad, temperatura, pH, luz y contaminación que afectan a la calidad y cantidad de la colonización microbiana y en consecuencia a la deterioración de los materiales utilizados en objetos de PC. Las causas principales de la biodeterioración son, el inadecuado almacenamiento, la falta de control de factores ambientales como: la temperatura, la humedad, la luz, una circulación de aire limpio en un microclima controlado, los cuales favorecen el crecimiento de biodeteriogenes. Se ha definido bioreceptividad como la capacidad de un material de ser colonizado por organismos vivos, así la bioreceptividad del papel a los hongos es alta, y debido a esto su higroscopicidad y composición (celulosa, hemicelulosa, lignina) representan una fuente de carbón abundante para estos biodeteriogenes. Las bacterias también deterioran los materiales de papel, pero a diferencia de los hongos, estos biodeteriogenes requieren menos humedad para desarrollarse y colonizar sobre las superficies de estos materiales. Cuando el papel es atacado por hongos, diferentes productos metabólicos son excretados (glicerinay acumulados en el material, la mayoría de los cuales continúan su efecto perjudicial. La descomposición de la celulosa por hongos celulíticos se debe a la producción y secreción de enzimas extracelulares-celulasas- que hidrolizan la macromolécula de celulosa en pequeñas azucares solubles en agua, las que pueden ser procesadas por los hongos. La deterioración causada por esas enzimas y por los acidos orgánicos excretados, causan una pérdida gradual de la fuerza mecánica del papel. En la etapa final de deterioración, el manejo del papel se hace difícil y sufre una desintegración y perdida de la información que contiene. Además, la presencia de pigmentos de color formados por otros procesos metabólicos también contribuye con la ilegibilidad de la información. En materiales hechos de madera, la pared celular es organizada en capas de diferentes espesores y diferentes relaciones de celulosa, hemicelulosa, y la matriz de lignina. Los hongos, debido a su modo nutricional saprófito contribuyen significativamente a la biodeterioración de los objetos de madera de PC, causando daños estructurales y estéticos. Los cambios causados por esos biodeteriogenes son principalmente la biodegradación enzimática de varios productos metabólicos. Una descomposición leve en madera reportada, es causada por hongos clasificados taxonómicamente -filum Ascomycota- junto a otras especies amorfas. El decaimiento de esta descomposición leve se caracteriza por cavidades formadas dentro de las paredes celulares en la madera y continúa en dirección a las microfibrillas de la celulosa. Este tipo de decaimiento se produce cuando la madera está expuesta a una excesiva humedad, pero también puede producirse en ambientes secos. El ataque se localiza en la capa media de las paredes secundarias. La descomposición leve de hongos pude biodegradar la celulosa y hemicelulosa, mientras la lignina es modificada solo parcialmente. Las enzimas hidrolizantes de la celulosa son categorizadas como endogluconasas y exogluconasas que actúan sinérgicamente. La biodegradación de la hemicelulosa (xylan) requiere de b-1,4 xylanasa, pero debido a la compleja estructura de la pectina otras enzimas están involucradas es esta degradación. Los materiales textiles hechos de fibras naturales, son un blanco de ataque biodetriogenes y degradación, como resultado se tiene la descolorizacion, manchado y pérdida de fuerza en su estructura mecánica. Además, estos pueden actuar como portadores de biodeterigenes como bacterias patogénicas, hongos y generadoras de olor. Como la mayoría de los textiles históricos de PC consisten de materiales orgánicos, están en riesgo. Por ejemplo, los rayos UV causan oxidación de los polímeros que constituyen las fibras naturales, lo cual resulta en la ruptura de enlaces intramoleculares y facilita la penetración de enzimas microbianas. Los materiales como piedra, roca y arcilla utilizados en la construcción de sitios arqueológicos, estatuas, monumentos, etc. la biodeterioración de estos objetos de PC es un proceso complejo debido a que están expuestos a un medio ambiente pobre en nutrientes, con grandes cambios de humedad, erosion mecánica, debido a la lluvia y altas dosis de radiación UV. Además, están poblados de hongos y otros microorganismos en todas las regiones y climas en la tierra, causando daños irreversibles (cambios estéticos, físicos y químicos) como la destrucción y pérdida de éstos. Los hongos epiliticos, (habitan sobre la roca) y endoliticos (habitan dentro de los poros y fisuras), estos son los principales actores en la erosión de materiales hechos de roca. Los hongos endoliticos son extremadamente erosivos, debido a su elevada actividad en construcciones de piedra con mortero o yeso. En climas húmedos moderados las comunidades de hongos son dominadas por hyphomycetos. En climas semi-aridos, aridos las comunidades de hongos cambian hacia micro-colonias de hongos negros y a menudo se presentan asociados con líquenes. Los hongos negros habitan dentro del granito, piedra caliza y mármol, estos erosionan mediante ataque mecánico y químico. Las cianobacterias, algas y líquenes contribuyen a la erosión de los objetos de piedra en climas húmedos, semiáridos y áridos. Los principales biodeteriogenes que afectan a los objetos de PC se describen en la Tabla 1.

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Tabla 1.

3. Herramientas biotecnológicas para identificar y caracterizar biodeteriogenes

Actualmente existen varias tecnicas moleculares que junto al uso de luz y microscopia electronica sirven para la identificar y caracterizar biodeteriogenes presentes en materiales utilizados para la construcción de objetos de PC. Para hongos se emplea desde el clásico metodo de cultivo standard utilizando el medio de cultivo PDA, MEA, DG18, cy205 y el medio de diclorano de rosa de bengala (DRBC), hasta el uso de tecnicas moleculares modernas para obtener una vision mas profunda y comprender las estructuras de comunidades de biodeteriogenes y sus consecuencias sobre el decaimiento de los materiales. La identificacion de hongos en muestras aisladas de materiales aun se basa en estudios morfológicos utilizando la clave de identificacion para diferentes grupos taxonommicos. La identificacion mas confiable y con mayor resolucion está basada en la tipificacion multilocus de secuencias (MLST en Ingles) una tecnica genetica para la caracterizacion taxonomica de microorganismos. Incluyendo18S rDNA, 26S rDNA e Internal transcribed spacer (ITS en Ingles) regions 1 y 2, genes: el actin-, TEF1-,tubulin-y calmodulin-. La region ITS se refiere al espaciador de DNA localizado entre una subunidad ribosomal RNA (rRNA) pequeña y una subunidad grande de genes rRNA en el cromosoma o la correspondiente region transcrita en el precursor polycistronico transcrito del rRNA. Para estudios de comunidades microbianas colonizantes en materiales de objetos de arte, el metodo de huella molecular basado en PCR amplificacion de DNA es muy utilizado. un medio de cultivo en muestras de materiales. Otro metodo es el denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE en Ingles) basado en un analisis secuencial multilocus. Los genes de rRNA amplificados o la secuencia ITS desde diferentes especies de hongos muestran diferentes patrones electroforeticos de migracion. En consecuencia, la comunidad de hongos que colonizan en una muestra puede ser visualizadas por su perfil elelctroforetico. Lo cual permite el analisis de la diversidad microbinana en la muestra especifica, su comparacion con la huella de otras muestras, y la evaluacion y/o monitoreo en sitios fijos y en sitios temporales. Por otra parte, el analisis PCR en tiempo real permite la cuantificacion de especies simples o taxones mas altos en las muestras. El método de hybridizacion in-situ por fluorescencia (FISH en Ingles) se ha empleaso en estudios de becterias, archea y hongos implicados en la bioterioracion de superficies de objetos de PC. La ventaja de este método es que el análisis FISH realiza directamente en una cinta adhesiva que se emplea durante el muestreo del área biodegradada in-situ por los microorganismos, sin afectar la superficie del valioso material, Como el método FISH se dificulta utilizando sondas de ADN en hongos por la rigides de sus paredes celulares, hace poco se aplicó péptido de ácido nucleico (PNA in ingles) para deterctar fluorescencia in-situ de hongos filamentosos. La caracterización de biodeteriogenes se complementa con estudios de microscopia electronica, como la microscopia de escaneo electronico (SEM en Ingles), el cual ase puede acoplar a un difractor de electrones retrodispersados (BSD en Ingles) para determinar la morfologia de los biodeteriogenes, asi como la morfologia de las esporas y los residuos de hongos y bacteiras. Estos metodos ayudan a comprender el proceso de la biodeterioracion por hongos como base para elaborar y optimizar los metodos de tratamiento y prevencion. 

4. Tratamiento de biodeteriogenes por irradiación gamma (γ)  

El método físico principal para prevenir, frenar y eliminar a los biodeteriogenes en materiales de PC es el de irradiación γ y recientemente los haces de electrones, aunque la aplicación del primer método en objetos de PC es más amplia. La irradiación γ es la radiación electromagnética con la más alta energía y la longitud de onda más corta. Esta clase de radiación, además es usada para la esterilización materiales pertenecientes a otras áreas científicas, por ejemplo, la medicina, farmacia o agricultura. Generalmente se obtiene del Cobalto 60 (Co-60), un radioisótopo que emite rayos gamma continuamente con un tiempo de vida media de 5.27 años. En consecuencia, para irradiar materiales de objetos de PC en laboratorio, este debe ser blindado apropiadamente desde afuera con el objeto de prevenir riesgos a la salud y media ambiente. El efecto antimicrobiano por irradiación γ fue demostrado por Mink, ya en el año 1986. La actividad microbiocida de esta radiación iónica altamente penetrante se debe a la generación de radicales capaces de enlazarse a los enlaces carbón- carbón y asi destruir el DNA celular y convertir las celulas microbianas en inviables. 
 La desinfección de material de archivo con irradiación γ fue estudiada primeramente en Rusia a principios de 1960, desde entonces, muchos estudios se han desarrollado con objeto de determinar el nivel de radiación mínimo requerido para eliminar las especies más comunes de hongos identificadas en objetos de PC como archivos de papel, madera, textiles, pinturas, cerámica, etc. Así como la evaluación de los efectos que la irradiación γ tiene en esos materiales en periodos de tiempo corto y largo. La investigación bibliográfica indica que para especies de hongos, la dosis de absorción letal es de 18 kGy (kiloGrey) a una tasa de velocidad igual a 5 kGy/h, aunque a menores dosis ya son letales para varias especies. En algunas especies de hongos después de la irradiación, se observó un marcado incremento en la intensidad de la pigmentación, lo cual podría presentar un problema cuando documentos de PC sean tratados por este método. Los efectos de la radiación γ en muestras de papel analizadas bajo condiciones normales y en presencia de nitrógeno, con objeto de clarificar el rol del oxígeno en las reacciones de biodeterioración indican que la atmosfera de nitrógeno no tiene ningún efecto en la protección de la biodeterioración de papel. Estos resultados se pueden justificar por el efecto de la radiación γ sobre material orgánico, por un mecanismo similar al que se produce sobre los microorganismos - atraves de la formación de radicales que deterioran la materia orgánica- que también pueden actúan sobre otros materiales orgánicos, como la celulosa. Se predice un efecto sinérgico entre la radiación γ y el calor, este efecto permite una disminución en la dosis de radiación de unas veinte veces. Sin embargo, aún no se han reportado los efectos de esta combinación en materiales de PC. Por ejemplo, se evaluó la dosis de absorción letal de la radiación- γ sobre esporas de hongos en papel natural contaminado por hongos y el efecto de pre-tratamientos con niveles de temperaturas y humedades variables sobre niveles mínimos de dosis letal de radiación γ, determinándose que incrementando las dosis de radiación (2-20 kGy a una tasa de velocidad de 4.103 kGy/h) el número de hongos decreció, aunque a dosis entre 17.5 a 20 kGy se encontró hongos vivos en las muestras de papel. Cuando las muestras contaminadas con hongos sometidas a un pre-tratamiento comparativo, secadas a 50oC en un horno, muestran más resistencia a la radiación en comparación con muestras pretratadas con calor húmedo y muestras a temperatura ambiente de un lugar de almacenamiento. Se afirma que las conidias inactivas son más resistentes a condiciones extremas que las conidias activas u hongos en estado vegetativo, el mantenimiento de esa inactividad se considera que ocurre a baja concentración de agua, en la espora, es posible que en calor húmedo y condiciones ambientales, las esporas existentes en el papel podrían haber sido activadas y se tornen más susceptibles a la radiación. Por tanto, no es aconsejable un pre-tratamiento por calor húmedo porque deteriora los objetos de PC. 
También se evaluó el efecto de tratamiento por irradiación γ sobre celulosa pura, en muestras de papel remojado en agua, y congelado. Antes del análisis las muestras remojadas y congeladas fueron secadas en un horno ventilado o secado en vacío por liofilización (secado-congelado). La irradiación fue realizada a dosis entre 0 y 10 kGy, a una tasa de velocidad igual a 2.8 kGy/h. La combinación de ambos tratamientos tiene un efecto sinérgico en la biodeterioración de la celulosa, demostrando una caída drástica en grado de polimerización. Además, en las muestras irradiadas se observó una diminución leve en el pH y la aparición de una coloración amarillenta. Respecto a las muestras liofiizadas, estas mostraron una resistencia mecánica muy baja en comparación con las otras. Las pruebas de irradiación realizadas en muestras de papel bajo diferentes condiciones ambientales como en atmosferas de nitrógeno, vacío y muestras saturadas con agua, a dosis de irradiación entre 2 a 5 kGy a una tasa de velocidad de 14.7 kGy/h. Los resultados demuestran que en general, los resultados a diferentes condiciones ambientales no reducen los efectos nocivos causados por la radiación γ en las muestras de papel. En relación a pruebas antifungicas, solo las muestras saturadas mostraron una actividad antifungica en comparación con las muestras en atmosferas alteradas, la razón puede ser debido a los radicales también formados en el agua, lo cual podría añadir un poder germicida al tratamiento. La exposición a la radiación γ puede volver a la celulosa aún más susceptible de infestación. La despolimerización causada por la irradiación quiebra el polímero de la celulosa en pequeñas unidades las cuales pueden fácilmente disponibles como sustrato para los biodeteriogenes. 
En resumen, de los resultados obtenidos por varios estudios se puede concluir que la actividad antifungica de la radiación γ es dependiente de la dosis y varia con las especies de hongos y su estado de desarrollo. La exposición a esta radiación puede inducir a los hongos a producir más productos metabólicos coloreados y después de la irradiación los objetos de PC como el papel, textiles o madera serán más susceptibles a una mayor biodeterioración. Se indica que la radiación γ puede causar una severa despolimerización de la celulosa y un color amarillento. Sin embargo, un estudio de dosis absorbida, tasa de velocidad de irradiación y tiempo pueden evitar cualquier deterioro, así su resistencia mecánica y el pH de los objetos de PC irradiados permanecen sin alteración. Además, este tratamiento anti-fúngico no deja ningún residuo tóxico, pero tiene efectos acumulativos de biodegradación en los materiales tratados. 

5. Conclusiones y Recomendaciones 

Los biodeteriogenes, hongos y bacterias son considerados como agentes de biodeterioración de objetos de PC (archivos de papel, libros, pinturas, textiles, cerámicas, cuero, monumentos arqueológicos de piedra). Cuando estos son almacenados en condiciones ambientales inadecuadas los materiales utilizados en la fabricación de objetos de PC pueden son atacados y colonizados sobre la superficie de esos materiales. Para su caracterización e identificación de los biodeteriogenes, estos son aislados desde los materiales donde colonizan. Mediante el uso de herramientas biotecnológicas como técnicas moleculares y de microscopia electrónica es posible conocer la morfología de los biodeteriogenes y su identificación a nivel de género. Para la preservación y protección los objetos de PC, el método físico de irradiación γ es muy efectivo contra los hongos y sus esporas y se recomienda un estudio particular para cada objeto de PC midiendo dosis de absorción, la tasa de velocidad y el tiempo a efectos de evitar dosis elevadas que puedan afectar a los materiales como en el caso del papel puede ocurrir una de-polimerización de la celulosa subyacente y la aparición de características de envejecimiento.

Sobre Javier C. Ramírez Pérez

Ph.D. - Profesor Investigador en biotecnología ambiental
Javier Christian Ramírez Pérez nació en La Paz-Bolivia, tiene BS en Ingeniería Química (1994) UMSA-Bolivia, MSc. en Sistemas de ingeniería Ambiental (1998) Clemson University, SC-USA, a PhD em Ingenieía Ambiental y Ciencias (2005), Rutgers University of New Jersey-USA.
Su tesis post doctoral fue realizada en el Centro de Biotecnología para la Agricultura y el Ambiente - Oak Ridge, Instituto de Ciencia y Educación (ORIESE-USA) (2006-2009). Profesor Investigador del Departamento de Ingeniería Química - UMSA-Bolivia (1994-99; 2009, 2016). Profesor Adjunto de Investigación (2010-12) Chemistry Department, Kent State University, Stark OH-USA. Prometheus Research - Professor - Ecuador, Universidad de ESPOL, Yachay Tech (2012-2014), y UTPL (2014-2015).
Consultor para investigador y desarrollo nuclear de tecnología para la Agencia Nuclear Boliviana (2016-2017). Profesor Investigador Visitante en el Institute de Física de la Univeridad de San Pablo, Brasil. Autor / libros: Aerobic Biodegradation Kinetics of Solid Organic Wastes, 2013. Capítulos de libros y manuales de laboratorio, y más de 20 publicaciones; Sus investigaciones fueron presentadas en conferencias nacionales e internacionales.

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